ЛАБОРАТОРИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СИСТЕМАТИКИ

Научный руководитель: Картавцев Юрий Федорович, д.б.н., профессор, возглавляет лабораторию с 2012 года.

По состоянию на март 2018 года численность составляет 8 человек.

Лаборатория создана решением Ученого совета от 24 апреля 2012 г. с формальной датой основания по приказу от 04.05.2012. С момента создания лаборатории, ею руководит Ю.Ф. Картавцев. История лаборатории кратка, как видно, она существует формально лишь 5 лет. Однако, учитывая длинный путь её организатора в ИБМ и позднее в ННЦМБ, можно выявить несколько этапов становления нынешней Лаборатории молекулярной систематики. Так, в 1978 г. в ИБМ организована Группа генетики и воспроизводства лососевых, которая 8 лет проводила комплекс исследований с приложением в генетику естественного и искусственного воспроизводства лососей и изучением популяционного-генетической структуры основных видов тихоокеанских лососей. Заведующим группой был назначен Ю.Ф. Картавцев, а в её состав входили известные генетики ИБМ (М.К. Глубоковский, Е.М. Анбиндер, В.Т. Омельченко и др.) и приглашенные молодые выпускники из МГУ (А.Н. Северцов), ДВГУ (Н.Е. Полякова), Свердловского госуниверситета (М.В. Смирнов) и других учреждений. Позднее в 1995 г. в составе МБС "Восток" существовала научная группа под руководством директора МБС, которая выполнила оригинальные исследования популяционной организации северной креветки, одного из важнейших промысловых гидробионтов дальнего востока РФ. Эта работа выполнена в содружестве с учеными США, ПИНРО и ТИНРО и опубликована в серии международных статей и статей в центральных журналах РФ. После возврата из Республики Корея в 2006 г., с окончанием там работы по контракту, в составе Лаборатории генетики возник новый неформальный коллектив, возглавляемый Ю.Ф. Картавцевым - Группа генетических ресурсов. В этот период выполнена серия работ по генетике тихоокеанской мидии, дальневосточной красноперки, камбалообразных рыб. С этого периода в ИБМ начинает развиваться молекулярная филогенетика, с использованием методов секвенирования последовательностей нуклеотидов и в целом ММ для эволюционных и таксономических целей.

Основные направления исследований

Молекулярная систематика, молекулярная филогенетика, эволюционная генетика, сравнительная геномика. Исследования, ориентированные на создание и культивирование линий рыб с определенными полезными свойствами. Разработка принципов генетической безопасности и природопользования в отношении рыб и других гидробионтов хозяйствующими организациями и ведомствами.

Используемые подходы и методы:

• Молекулярной биологии и эволюционной генетики;
• Молекулярной филогенетики;
• Популяционной и экологической генетики;
• Генетики сохранения видов (Conservation Genetics);
• Систематики.

Важнейшие задачи лаборатории определяются тремя главными вызовами современной биологии:

1. Острой необходимостью описания биологического разнообразия (биоразнообразия) на современной молекулярно-генетической и информационной основе; вызовы глобализации торговли, экологические проблемы и урбанизация общества диктуют сжатость сроков исполнения этой задачи. Например, ориентир первого этапа международной программы iBOL для РФ - 2018 г. с ДНК-штрихкодированием 20000 образцов, 4000 видов и помещением материалов в мировые и собственные базы данных (БД).
2. Признанием мировым научным сообществом ДНК-штрихкодирования видов в качестве приоритетного глобального проекта по биоразнообразию iBOL и участием РФ как самостоятельного кластера этого проекта, что дает стране стимул для интеграции в передовые западные разработки, для активизации развития наукоемкого производства, образовательной и социальной сферы.
3. Важным прикладным значением многих видов как объектов промышленно-хозяйственного освоения и элементов среды обитания, их огромной ролью в продуктивности экосистем, необходимостью идентификации образцов фауны/флоры при пересечении границы РФ в интересах государственных учреждений и коммерческих организаций в связи с глобализацией торговли и экономическим ущербом для государства от недобросовестных участников сделок. Потенциальные потери достигают здесь до 50 млн. долларов ежегодно. Имеются также приложения подхода в сельское хозяйство, надзор за продуктами питания, биомедицину и др. Для РФ важность исследований состоит в междисциплинарности подхода и вовлеченности в него нескольких лабораторий и творческих групп, в том числе и из других учреждений ДВО РАН и из Дальневосточного федерального университета (ДВФУ). Кроме вышеперечисленных, лаборатория ориентирована на решение ключевых фундаментальных проблем общей биологии и генетики.

Спектр изучаемых организмов и объектов, география исследований

Исследование биологического разнообразия на основе ДНК-штрихкодирования представителей водной биоты дальнего востока РФ. Исследования лаборатории охватывают большой спектр объектов, включая несколько отрядов рыб (камбалообразные, окунеобразные, скорпенообразные, карпообразные и др.) многие таксоны беспозвоночных животных: двустворчатых, брюхоногих и голожаберных моллюсков, иглокожих, асцидий и других.

Коллектив располагает необходимым оборудованием для выполнения молекулярно-генетических работ. Имеются наборы реактивов для работ при проведении ПЦР и секвенировании ДНК. Сотрудники лаборатории владеют методами получения и анализа данных высокопроизводительного секвенирования на платформах Illumina (MiSeq) и 454 Life Sciences(Roshe, Junior), а также методами электронной микроскопии.

НИР лаборатории направлены на решение, как фундаментальных проблем, так и на социально ориентированные цели и задачи. В фундаментальной области - важнейшими в общей биологии являются проблемы биологического вида, его дефиниции и идентификации. Вопросы видообразования, филогенеза и соответствующих эволюционных реконструкций, немыслимы сейчас без конструирования молекулярных филогений. Общепринята в настоящее время синтетическая теория эволюции (СТЭ), частью которой является биологическая концепция вида (БКВ). Обоснование и систематическое изложение СТЭ представлено в работах Холдейна (Haldane, 1932), Добжанского (Dobzhansky, 1937; 1943; 1951; 1970), Хаксли (Huxley, 1954), Майра (Майр, 1968; Mayr, 1982). В России популярным обобщением СТЭ стала книга Тимофеева-Ресовского и соавторов (1977). Конструктивное развитие положений СТЭ и БКВ предложено, Воронцовым (1980), Харрисоном (Harrison, 1998) и др.

Одно из уязвимых мест СТЭ - отсутствие, как правило, возможности экспериментальной проверки ключевого в БКВ критерия не скрещиваемости видов в природе. Недавно, с развитием филогенетики, возникли новые противоречия между БКВ и филогенетической концепцией вида (Avise, Wollenberg, 1997; Avise, 2000; Harrison, 1998; Templeton, 1998), которые доходят даже до отвержения значимости для филогенетики текущих микроэволюционных процессов. Не вполне разработана в СТЭ и теория видообразования. Точнее говоря, в количественно-аналитическом смысле теория как таковая вообще не сформулирована, а имеется только некоторый набор концепций. Решение этих вопросов требует переописания биоразнообразия на современной молекулярной и биоинформационной основе, включая радикальное обновление музейных коллекций с формированием и пополнением БД общедоступных через Интернет.

В качестве обобщения в этом направлении можно сослаться на одно из основных достижений лаборатории за 2017 г.

Предложен оригинальный подход, базирующийся на специальной программной функции BIN (Barcoding Index Number) получения кластеров нуклеотидных последовательностей по молекулярным маркерам (ММ), и их сравнения с традиционной таксономической классификацией. Используя BIN и массив международной базы данных BOLD впервые удалось осуществить идентификацию таксонов рыб трех рангов вид, род, семейство и проделать статистическую оценку состоятельности идентификации. По большому массиву данных обнаружено, что ошибки идентификации по ММ не превышают 20%, а возможная ретикуляция генных деревьев достигает не более 16%. На основе полученных данных и материалов о связи молекулярной эволюции с иерархией таксонов в мире животных в целом, обосновывается соответствие молекулярной эволюции и существующих общебиологических и эволюционных парадигм, Нео-Дарвинизма и биологической концепции вида (Картавцев Ю.Ф., ННЦМБ ДВО РАН). Идентификация видов на основе молекулярных маркеров (ММ), а точнее на основе последовательностей нуклеотидов ДНК или ДНК-штрихкодов (ДНК-штрихкодирование, iBOL; www.ibol.org ), является весьма успешной, как убеждают обширные данные мировой базы данных (БД), BOLD (www.bold.org). Однако теория, которая объяснила бы данный факт, пока не создана. В представляемой работе предложен оригинальный подход, базирующийся на Величине Индекса ДНК-штрихкодирования (Barcoding Index Number, BIN). Используя BIN и массив БД BOLD удалось осуществить идентификацию (выделение) таксонов трех рангов (вид, род и семейство) и проделать статистическую оценку состоятельности идентификации, которая достигает более 80% (Рис. 1). Кроме того, доказано, что для большинства построенных генных деревьев для маркера Со-1 (ген цитохром оксидазы с, субъединица 1) существует хорошее соответствие их топологии и общепринятой таксономической классификации в иерархии таксонов вид, род, семейство, по меньшей мере для проанализированных обширных данных по рыбам; коэффициент детерминации связи составил: (R² = 0.84-0.98, P < 0.001; Рис. 2). Полученные знания об отклонениях от предсказанных значений для идентификации видов и определения ранга других таксонов позволят улучшить систему описания биоразнообразия на точной молекулярной и биоинформационной основе. Основной вывод из проделанного анализа состоит в том, что успешная идентификация по ММ возникает вследствие преобладания в природе географического способа видообразования. В ходе длительного во времени процесса формирования видов, с накоплением мутаций и соответствующих многочисленных нуклеотидных замен в различных дочерних предковых таксонах, могут возникать уникальные последовательности нуклеотидов, ДНК-штрихкоды, которые обнаруживаются посредством ММ. Последующая независимая эволюции возникших филетических линий, включая дальнейшую дивергенцию до уровня рода и семейства и так далее, и составляет фактическую базу обнаруженной связи величины значения BIN и ранга для трех таксонов, выделенного посредством традиционного морфологического подхода (Рис. 2). В целом связь генетических расстояний и ранга таксона доказана для различных групп животных по данным для отдельных генов и для полных митогеномов (Рис. 3).

Рис. 1. Двухфакторный дисперсионный анализ распределения средних значений классификаций на основе BIN в двух исследованиях рыб, суммированных по базе данных BOLD.

Средние значения для BIN показывают согласованные классификации (%, Y-ось) по молекулярному маркеру Co-1 мтДНК видов/образцов с независимым диагнозом по традиционным признакам, представленным в BOLD. Группы сравнения (Comparison group, X-ось) представлены двумя категориями: отдельные виды (1) и самостоятельные роды (2). Значения согласованной классификации (concordant classifications) не различаются в двух группах (1 и 2). Оценки также не отличаются между двумя исследованиями (Steinke et al., 2009, TZFPC; Turanov et al., 2014, FERU), которые представили 1219 и 285, а также 199 и. 64 проанализированных образцов для видов и родов в двух цитированных работах. Суммарная согласованность классификаций на основе оценок BIN составила более 82% (см. точки с доверительными интервалами на графике); соответственно величина ошибочных классификаций составляет менее 18% (по Kartavtsev, 2017).

Рис. 2. Регрессионный анализ распределения значений BIN, размещенных в базе данных BOLD для трех проектов исследования рыб, FERU/TZFPC и SCFAA (По Kartavtsev, 2017).

Значения по Y-оси, LOG (BIN-ALL) (переменная, представляющая значения зоологически определяемых образцов для трех категорий, обозначенных в BOLD: внутри видов, внутри родов и внутри семейств) в сопоставлении со значениями по X-оси, LOG (BIN-CONCRDANT) (Согласующиеся OTU-кластеры для Co-1 мтДНК ДНК-штрихкодов или образцов последовательностей для тех же трех выше описанных категорий). Изменчивость показывает статистически значимую положительную линейную зависимость двух переменных X и Y для проанализированных проектов FERU/TZFPC (слева; Steinke et al., 2009, TZFPC; Turanov et al., 2014, FERU) и SCFAA (справа; McCusker et al. 2012). Суммарная ковариация двух переменных на основе значений BIN в проектах составила: R² = 98% и R² = 84%, соответственно для двух графиков. То есть, ошибки в детерминации составили: 2-16%. Подробности представлены в статье (Kartavtsev, 2017; Supplement, DATA1, DATA2, DATA3 spreadsheets).

Рис. 3. Распределение р-расстояний в таксонах животных.

График (А) слева демонстрирует изменчивость средних значений р-расстояний (P-distance; ось-Y) для последовательностей генов Cyt-b и Co-1 различных таксонов животных в зависимости от ранга групп, в двухфакторном дисперсионном комплексе. Группа сравнения (Group of Comparison): 1 - внутри видов, между особями одного вида, 2 - внутри подвидов, полувидов и близнецовых видов, между особями этих таксонов, 3 - внутри рода, между морфологически различающимися видами одного рода, 4 - внутри семейства, между видами различных родов одного семейства, 5 - внутри отряда, между видами различных семейств одного отряда. На график отражена изменчивость групп сравнения без взвешивания расстояний на число видов (n). Проиллюстрирован эффект взаимодействия, то есть, различия величин расстояний для двух генов в пяти группах сравнения: F = 101.05, d.f. = 4, 22227, P < 0.0001. Вертикальные линии - доверительные интервалы (95%) для средних значений (По Kartavtsev, 2011a,b). На графике (B) справа показана изменчивость 3 групп сравнения для митогенома, включающего 13 белок-кодирующих генов у ельцовых рыб (Kartavtsev et al., 2017). Для ельцовых рыб включены 3 группы сравнения (Group of Comparison): (1) внутри вида, (2) внутри рода, (3) внутри подсемейства.

Публикации:

Kartavtsev Y. Barcode index number, taxonomic rank and modes of speciation -- examples from fish. MITOCHONDRIAL DNA PART A, 2017. E-publ. https://doi.org/10.1080/24701394.2017.1315570; WoS 2016 IF = 1.76.

Kartavtsev Yu. Ph., Batishcheva N.М., Bogutskaya N.G., Katugina A.O., Hanzawa N. Molecular Systematics Research, DNA Barcoding of Altai Osmans, Oreoleuciscus (Pisces, Cyprinidae, Leuciscinae), and Nearest Relatives, Inferred from Sequences of Cytochrome b (Cyt-b), Cytochrome Oxidase c (Co-1), and Complete Mitochondrial Genome // MITOCHONDRIAL DNA PART A, 2017. V. 28. P.502-517. WoS 2016 IF = 1.76.

Основные фундаментальные и прикладные результаты

Для примера, приведем лишь одно из недавних достижений лаборатории, сформулированное в 2016 г., которое достаточно наглядно излагает текущие НИР.

Формулировка результата:

В рамках глобального проекта по описанию биоразнообразия, с использованием молекулярных маркеров генов и методологии ДНК-штрихкодирования впервые получены оригинальные данные о систематике, распространении и механизмах видообразования ельцовых (Leuciscinae) и бельдюговидных (Zoarcales) рыб, некоторых таксонов головоногих (Cephalopoda) и голожаберных (Gastropoda) моллюсков, а также колониальной асцидии Didemnum vexillum из дальневосточных морей России совместно с пополнением соответствующих баз данных, способствующих более качественной работе систематиков, музейных работников и представителей рыбной промышленности (д.б.н. Картавцев Ю.Ф., к.б.н. Туранов С.В., к.б.н. Чичвархин А.Ю., Золотова А.О., Чичвархина О.В., д.б.н. Звягинцев А.Ю., ННЦМБ ДВО РАН; совместно с МГУ им. М.В. Ломоносова, к.б.н. Екимова И.А. и ТИНРО-центром, к.б.н. Катугин О.Н.).

Аннотация:

На основе молекулярных маркеров (ММ) генов проведена идентификация более 500 представителей ряда таксонов рыб и беспозвоночных животных дальневосточных морей РФ. Выполненная работа существенно улучшила понимание системы этих таксонов и идентификацию особей, в том числе объектов промысла, имея, соответственно, как фундаментальное значение, так и практическую ценность. Впервые для РФ реализован комплексный международный подход (www.ibiol.org; www.bolsystems.org), который включает:

1. квалифицированное определение видовой принадлежности отловленных гидробионтов специалистами по группам,
2. систематический сбор и хранение образцов тканей и выделение ДНК,
3. стандартизацию препаратов ДНК и экспресс-анализ последовательностей ДНК (секвенирование),
4. создание и поддержание собственных баз данных, представляющих собой: а) крио-коллекции образцов тканей, б) ДНК-коллекции и в) компьютерные базы данных первичных нуклеотидных последовательностей, зарегистрированных в глобальных базах данных (GenBank/ BOLD) (в основном по Co-1, а также по Cyt-b и другим ММ),
5. содержательный биоинформационный анализ вновь полученных данных с использованием новейших подходов.

Эти подходы включают:

1. конструирование генных деревьев,
2. оценку состоятельности топологий деревьев на основе нескольких подходов (ML, MP, BI, NJ),
3. поиск разрывов или хиатусов в массивах данных ММ на основе не древо-подобных алгоритмов - ABGD (Automatic Barcoding Gap Discovery) и др.,
4. поиск, классификацию образцов и идентификацию таксонов с использованием коалесцентных подходов - PTP (Poisson Tree Processes). GMYC (Generalized Mixed Yule Coalescent) и др.

Выполнена комплексная работа по 6 разделам, включающая оригинальные исследования, организованные по единой признанной международным сообществом методологии:

1. Молекулярная таксономия, ДНК-штрихкодирование алтайских османов, Oreoleuciscus (Pisces, Cyprinidae, Leuciscinae) и близких родственников на основе последовательностей цитохрома b (Cyt-b), цитохромоксидазы c (Co-1) и полного митохондриального генома;
2. Молекулярно-филогенетическая реконструкция и таксономическое исследование бельдюговидных рыб (Cottoidei: Zoarcales) на основе митохондриальных генов Co-1 и Cyt-b;
3. ДНК-штрихкодирование кальмаров семейства Gonatidae (Cephalopoda: Teuthida) из Бореальной зоны северной Пацифики;
4. ДНК-идентификация колониальной асцидии Didemnum vexillum Kott, 2002 - чужеродного вида в заливе Петра Великого (Японское море);
5. Комплексное исследование Janolus fuscus O’donoghue, 1924 (GASTROPODA: PROCTONOTIDAE) - представителя нового для морей России семейства голожаберных моллюсков;
6. ММ и определение видовой принадлежности голожаберного моллюска рода Cuthona Alder et Hancock, 1855 (Gastropoda: Tergipedidae), ассоциированного с раками-отшельниками из Японского моря.

По этой НИР опубликовано 6 статей:

Kartavtsev Yu. Ph., Batishcheva N.М., Bogutskaya N.G., Katugina A.O., Hanzawa N. Molecular Systematics Research, DNA Barcoding of Altai Osmans, Oreoleuciscus (Pisces, Cyprinidae, Leuciscinae), and Nearest Relatives, Inferred from Sequences of Cytochrome b (Cyt-b), Cytochrome Oxidase c (Co-1), and Complete Mitochondrial Genome // MITOCHONDRIAL DNA PART A, 2016. E-publication. http://dx.doi.org/10.3109/24701394.2016.1149822. WoS IF = 1.76

Turanov S.V., Kartavtsev Yu. Ph., Lee Y.-H., Jeong D. Molecular-phylogenetic reconstruction and taxonomic investigation of eelpouts (Cottoidei: Zoarcales) based on Co-1 and Cyt-b mitochondrial genes // MITOCHONDRIAL DNA PART A, 2016. E-publication. http://dx.doi.org/10.3109/24701394.2016.1155117. WoS IF = 1.76

Katugin O.N., Chichvarkhina O.V., Zolotova A.O., Chichvarkhin A. DNA barcoding for squids of the family Gonatidae (Cephalopoda: Teuthida) from the boreal North Pacific // Mitochondrial DNA PART A, 2015. E-publication. http://dx.doi.org/10.3109/19401736.2015.1110792. WoS IF =1.76

Звягинцев А.Ю., Санамян К.Э., Туранов С.В., Картавцев Ю.Ф. Колониальная асцидия Didemnum vexillum Kott, 2002 - чужеродный вид в заливе Петра Великого (Японское море) // Российский Журнал Биологических Инвазий, 2016. № 2. С. 49-59. РИНЦ IF = 0.6

Чичвархин А.Ю., Чичвархина О.В., Картавцев Ю.Ф. Janolus fuscus O’donoghue, 1924 (GASTROPODA: PROCTONOTIDAE) - представитель нового для морей России семейства голожаберных моллюсков // Биология моря, 2016. том 42. № 6. с. 13-18. WoS IF = 0.6.

Чичвархин А.Ю., Екимова И.А., Чичвархина О.В., Егорова Е.Л. Видовая принадлежность ассоциированного с раками-отшельниками голожаберного моллюска рода Cuthona Alder et Hancock, 1855 (Gastropoda: Tergipedidae) из Японского моря // Биология моря. 2016. Т. 43, № 6. C. 449-457. WoS IF = 0.6.

Сотрудники лаборатории активно сотрудничают с российскими и зарубежными коллегами.

Лаборатория ведет обширную организационную работу, регулярно проводя самостоятельные мероприятия, а также принимает участие во многих международных конгрессах, конференциях и симпозиумах.

В 2015 и 2017 гг. лаборатория выступила как основной организатор двух международных симпозиумов, проводимых в среднем с периодичностью два года. В период с 6 по 10 сентября 2015 г. на базе ННЦМБ ДВО РАН состоялся Международный симпозиум "Современные достижения в популяционной, эволюционной и экологической генетике" (MODERN ACHIEVEMENTS IN POPULATION, EVOLUTIONARY AND ECOLOGICAL GENETICS, MAPEEG-2015). Ранее 1-6 сентября 2015 г. на МБС "Восток" ННЦМБ проведена школа MolSys. Организаторами обеих мероприятий являлись Дальневосточное отделение РАН, ННЦМБ ДВО РАН, ФНЦ биоразнообразия наземной биоты восточной Азии ДВО РАН, Владивостокский общественный фонд развития генетики, Дальневосточный федеральный университет и Администрация г. Находка. Тема очередного, девятого симпозиума, проведенного в 2017 г., была традиционна: "Современные достижения в популяционной, эволюционной и экологической генетике" (Modern Achievements in Population, Evolutionary, and Ecological Genetics: International Symposium). Сайт мероприятия: http://wwwimb.dvo.ru/misc/mapeeg/index.php/ru/.

Проведенные симпозиумы способствовали освоению новых направлений исследований по областям науки из их тематики, обмену опытом и навыкам выступления на английском языке, который являлся рабочим языком симпозиумов. Симпозиумы предоставили возможность специалистам РФ и других стран доложить о своих новейших научных результатах и получить критическую оценку от специалистов высшей квалификации по своим областям, что особенно важно для молодых специалистов.

Информация подготовлена научным руковдителем Лаборатории молекулярной систематики д.б.н., профессором Ю.Ф. Картавцевым.