ЛАБОРАТОРИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Научный руководитель: Одинцова Нэлия Адольфовна, д.б.н., профессор, возглавляет лабораторию с начала ее образования в 2009 г.

По состоянию на март 2018 года численность составляет 6 человек.

Одинцова Нэлия Адольфовна - гл.н.с., д.б.н., профессор, Curriculum Vitae (.pdf)
Агеенко Наталья Викторовна - н.с., к.х.н., Curriculum Vitae (.pdf)
Борода Андрей Викторович - ст.н.с., к.б.н., Curriculum Vitae (.pdf)
Кипрюшина Юлия Олеговна - н.с., к.б.н., Curriculum Vitae (.pdf)
Майорова Мария Андреевна - н.с., к.б.н., Curriculum Vitae (.pdf)
Яковлев Константин Владимирович - н.с., к.б.н., Curriculum Vitae (.pdf)

В 2009 году группа научных сотрудников под руководством Н.А. Одинцовой была выведена из состава Лаборатории биофизики клетки в самостоятельную Лабораторию клеточных технологий для разработки технологий индукции пролиферации стволовых клеток морских гидробионтов и их дифференцировки в определенный клеточный тип; а также технологий криосохранения клеток этих животных.

Сотрудниками лаборатории разработаны специфические питательные среды для культивирования клеток разных типов морских беспозвоночных, проведена морфологическая, биохимическая и функциональная характеристика клеток в условиях культуры. В тканях морских беспозвоночных был обнаружен новый ростовой фактор, сходный с эпидермальным фактором роста и способный стимулировать рост клеток, как позвоночных, так и беспозвоночных животных. Впервые определены наиболее предпочтительные субстраты для культивируемых клеток моллюсков и иглокожих. Установлено, что некоторые биологически активные вещества из тканей морских беспозвоночных (в частности, лектины из тканей асцидий) обладают свойствами как адгезивных факторов, так и факторов роста, и способны влиять на рост и дифференцировку эмбриональных клеток моллюсков и иглокожих, а также клеток млекопитающих. Кроме того, впервые осуществлен перенос транскрипционного активатора экспрессии эукариотических генов, гена gal4, в эмбрионы морских ежей, а также в клетки первичных культур этих животных. Ген активировал процессы неорганизованного роста клеток эмбрионов, увеличивал синтез ДНК и пролиферативную активность. Это открытие мировой значимости в области морской биотехнологии, подтверждено патентом России, дает новые возможности для получения постоянных клеточных культур морских беспозвоночных.

Отдельным блоком стоят исследования, связанные с поиском новых криопротекторов и направленные на создание Криобанка биологического материала морских гидробионтов. Продолжаются исследования закономерностей клеточных ответов и дифференцировки клеток морских животных в культуре в благоприятных условиях и при стрессовых воздействиях различной природы (химические вещества, температура), расширяются представления о механизмах контроля роста и дифференцировки у морских гидробионтов. Получаемые результаты представляют собой основу для разработки стратегии выживания видов при наступлении неблагоприятных условий и важны для будущих биотехнологических инноваций, разработки клеточных моделей для экотоксикологических исследований.

Все сотрудники лаборатории участвуют в подготовке специалистов в области клеточной биологии, биохимии и биотехнологии.

Основные направления исследований:

• разработка технологий индукции пролиферации стволовых клеток морских гидробионтов и их дифференцировки в определенный клеточный тип;
• создание новых криопротекторов и разработка технологий криосохранения клеток морских гидробионтов при сверхнизких температурах.

Объектами исследования лаборатории являются эмбрионы, личинки, половые, эмбриональные и соматические клетки двустворчатых моллюсков, иглокожих и ракообразных, а также клетки и ткани морских млекопитающих (акватории России).

Используемые подходы и методы включают современные биохимические, цитологические и молекулярно-биологические методы исследования – культуру клеток морских беспозвоночных, методы биологии развития, молекулярно-генетические методы (выделение ДНК и РНК, ПЦР, ОТ ПЦР, секвенирование отдельных участков ДНК, клонирование), методы микроскопии, включая криомикроскопию, методы иммунохимии с последующей конфокальной микроскопией, методы хроматографии (тонкослойной и газо-жидкостной), масс-спектрометрию.

Исследования проводятся с использованием стерильного помещения, оснащенного ламинарными шкафами, углекислотным инкубатором (для клеток млекопитающих), климатической камерой (для клеток морских беспозвоночных) и инвертированным микроскопом с системой фазового контраста и камерой для работ с культурами клеток, проточного цитофлуориметра для быстрого и точного анализа состояния клеток, программного замораживателя для контролируемой криоконсервации тканей и культур клеток морских гидробионтов, а также комплекса оборудования ЦКП по электронной микроскопии ННЦМБ ДВО РАН. Кроме того, для работы привлекается оборудование других институтов ДВО РАН.

Проводимые сейчас исследования:

Иccледовано фоpмиpование микpочаcтиц льда в тонком cлое водныx pаcтвоpов кpиозащитныx вещеcтв пpи оxлаждении до темпеpатуpы -196°C. Пpи темпеpатуpаx ниже 0°C наблюдали обpазование cплошного маccива льда, дальнейшее оxлаждение вызывало pаcтpеcкивание льда за cчет возникновения теpмомеxаничеcкиx напpяжений и фоpмиpование микpочаcтиц. Фоpма и pазмеp чаcтиц завиcели от cоcтава замоpоженного pаcтвоpа и cкоpоcти оxлаждения. Компоненты кpиозащитныx pаcтвоpов cущеcтвенно изменяли фоpму и pазмеpы микpочаcтиц льда.

Произведено взятие биоптатов кожи 13 особей, принадлежащих к 6 видам морских млекопитающих. Изолированы первичные культуры фибробластов. Определены оптимальные условия их культивирования. Фибробласты из кожи некоторых морских млекопитающих получены посмертно. Основными критериями оценки качества полученных фибробластов стали морфология и распределение двух цитоскелетных белков (актина и тубулина). Функционально активные фибробласты будут использованы на следующей стадии генерации iPSCs (индуцированных стволовых клеток). Образцы кожи и культуры успешно заложены в криобанк для хранения. В будущем возможны межгосударственные обмены между криобанками и создание единой сети криобанков.

Установлено, что активная дифференцировка пигментных клеток у морских ежей, которая происходит как результат реакции на стресс, сопровождается усиленной экспрессией генов, участвующих в биосинтезе нафтохинонов. Оценка степени влияния этих генов на криоустойчивость неоднозначна.

Обнаружено, что в яйцеклетках морских ежей материнские половые детерминанты равномерно локализованы на периферии клеток в кортикальном слое и связаны с актиновыми филаментами.

Впервые осуществлено заражение гемоцитов здоровых крабов герпес-подобным вирусом из замороженных тканей больных крабов. Получены доказательства возможности передачи инфекции в культуре клеток.

Исследования коллектива лаборатории были поддержаны грантами РФФИ (2007-2009, 2011-2014); CRDF (2014-2015); Российским научным фондом (2014-2016); грантами Дальневосточного отделения РАН (2009-2011, 2012-2014, 2015-2017); грантом Президента РФ (2017-2018).

Основные фундаментальные и прикладные результаты:

1. Получены результаты, указывающие на единство сигнальных путей, регулирующих развитие нервной системы у разных типов животных. Исследована роль рецепторов внеклеточного матрикса, интегринов, участвующих в реализации миогенной и нейрональной дифференцировки у млекопитающих, в формировании мышечной и нервной систем у двустворчатых моллюсков. Установлено, что один из таких рецепторов, альфаV бета3-подобный интегрин, важный для миогенной дифференцировки клеток млекопитающих, не участвует в миогенной дифференцировке клеток моллюсков, но солокализован с характерными для моллюсков нейрональными маркерами - нейромедиаторами серотонином или нейропептидом FMRFамидом.

   Odintsova N.A., Maiorova M.A. Localization of alphaV beta3-like integrin in cultivated larval cells of the mussel Mytilus trossulus during neuronal and muscle differentiation //Journal of Molecular Histology 2012. V. 43, № 4. P. 449-459.

2. Впервые установлено, что активная дифференцировка пигментных клеток у морских ежей, которая происходит как результат реакции на стресс, сопровождается усиленной экспрессией генов, участвующих в биосинтезе нафтохинонов. Разработана технология направленной дифференцировки пигментных клеток эмбрионов морских ежей, способных продуцировать биоактивные вещества с терапевтическим потенциалом в условиях культуры (Совместно с БПИ ДВО РАН).

   Ageenko N.V., Kiselev K.V., Odintsova N.A. Expression of Pigment Cell-Specific Genes in the Ontogenesis of the Sea Urchin Strongylocentrotus intermedius // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (eCAM journal). 2011. https://doi.org/10.1155/2011/730356

   Ageenko N.V., Kiselev K.V., Dmitrenok P.S., Odintsova N.A. Pigment cell differentiation in blastula-derived primary cell cultures of sea urchins //Marine Drugs. 2014. Special issue: Advances and New Perspectives in Marine Biotechnology. V. 12. P. 3874-3891. https://doi.org/10.3390/md12073874

   Ageenko N.V., Kiselev K.V., Odintsova N.A. Freezing tolerance of sea urchin embryo pigment cells // Russian J. Marine Biology. 2016. V. 42, № 5. P. 437-441.

3. Впервые проанализированы данные о структуре и роли факторов роста и их рецепторов, принадлежащих семейству VEGF и VEGFR, в развитии беспозвоночных животных, с особым акцентом на роль этих факторов в органогенезе и регенерации. Обнаружено, что экспрессия большинства генов этого семейства начинается в процессе развития на стадии гаструляции и органной дифференцировки. На основе собственных и литературных данных сделан вывод, что основная биологическая функция VEGF/VEGFR сигнального пути связана с контролем миграции клеток и развития ветвящихся органов как у позвоночных, так и беспозвоночных животных.

   Kipryushina Y.O., Yakovlev K.V., Kulakova M.A., Odintsova N.A. Expression pattern of Vascular endothelial growth factor-2 during sea urchin development // Gene Expression Patterns. 2013. V. 13, № 8. P. 402-406.

   Kipryushina Y.O., Yakovlev K.V., Odintsova N.A. Vascular endothelial growth factors: A comparison between invertebrates and invertebrates // Сytokines and Growth Factor Reviews. 2015. V. 26, № 6. P. 687-695.

4. Проведена оценка распространенности герпес-подобного вируса в природных популяциях королевских крабов Северной Пацифики, охарактеризованы гистопатологические изменения в зараженных вирусом клетках и тканях, в том числе на ультраструктурном уровне. Впервые осуществлено заражение гемоцитов здоровых крабов герпес-подобным вирусом из замороженных тканей больных крабов. Разработанный способ искусственного заражения в условиях культуры может стать ключом для идентификации различных потенциально-опасных инфекций крабов.

   Ryazanova T.V., Eliseikina M.G., Kalabekov I. M., Odintsova N.A. A herpes-like virus in king crabs: characterization and transmission under laboratory condition // Journal of Invertebrate Pathology. 2015. V. 127. P. 21-31.

   Odintsova N.A., Eliseikina M.G, Ryazanova T.V. Experimental Infection of King Crab Hemocytes with a Herpes-like virus in Culture // Russian Journal of Marine Biology, 2015, v. 41 (5). P. 401-404.

5. Впервые установлены основные пути гибели клеток после криоконсервации в культуре клеток личинок морских ежей и двустворчатых моллюсков. Обнаружено, что помимо механического разрушения клеток, которое было связано с самим процессом замораживания, большинство клеток умирали в результате некроза или апоптоза. Апоптоз - не основной путь смерти для клеток этих животных после криоконсервации, но его индукция проходила в значительной части клеток сразу после оттаивания и зависела от используемого криопротектора. Развитие этого направления важно для определения механизмов криоустойчивости морских организмов

   Boroda A.V., Kipryushina Y.O., Yakovlev К.V., Odintsova N.A. The contribution of apoptosis and necrosis in freezing injury of sea urchin embryonic cells // Cryobiology. 2016. V. 73. P. 7-14.

   Оdintsova N.A., Boroda A.V., Maiorova M.A., Yakovlev K.V. The death pathways of mussel larval cells after a freeze-thaw cycle // Cryobiology, 2017. V. 77. P. 41-49.

6. В результате анализа механизмов установления внутриклеточной асимметрии, вследствие которых клетка приобретает полярность, было получено еще одно подтверждение того, что механизмы поляризации в бластомерах ежей начинают активироваться только в ходе первых дроблений эмбрионов. Выдвинуто предположение, что в клетках дрозофилы локальная трансляция консервативных белков поляризующих комплексов является частью механизма, устанавливающего и поддерживающего полярность клеток (совместно с Институтом биологии гена РАН, Россия, и Университетом Принстона, США).

   Yakovlev K.V. Localization of germ plasm-related structures during sea urchin oogenesis // Developmental Dynamics. 2016. V. 245, № 1. P. 56-66.

   Barr J., Yakovlev K.V., Shidlovskii Y., Schedl P. Establishing and maintaining cell polarity with mRNA localization in Drosophila // Bioessays. 2016. V. 38, № 3. P. 244-253).

Сотрудники лаборатории активно сотрудничают с российскими и зарубежными коллегами, участвуют в престижных всероссийских и международных конференциях, неоднократно получали именные премии, награды, гранты российских и зарубежных фондов, грант Президента Российской федерации.

Информация подготовлена старшим научным сотрудником Лаборатории клеточных технологий к.б.н. А.В. Бородой.