Лаборатория биотехнологии и молекулярной биоинженерии

Научный руководитель: Гринченко Андрей Викторович, к.б.н., с.н.с., возглавляет Лабораторию с момента создания в мае 2024 года.

В составе лаборатории 12 сотрудников.

Основные направления исследований

• Поиск и изучение структурно-функциональных свойств биополимеров морских организмов.
• Биотехнология морских продуцентов ценных биологически активных соединений.
• Рациональный дизайн и биоинженерия белков.
• Разработка технологий и средств медицинского и акваветеринарного назначения.

Используемые подходы и методы

Рациональный дизайн в биоинженерии белков для нужд персонифицированной медицины требует углубленного изучения их структурно-функциональных свойств и, таким образом, комплексного подхода с применением знаний и навыков во множестве смежных областей биологии, биофизики и фундаментальной медицины. Поиск природных белков-кандидатов момент может проводиться как биохимическими методами, так и биоинформатическими подходами. Получение рекомбинантных форм и их направленный мутагенез требует навыков в молекулярной биологии и биотехнологии, в частности в генной инженерии. Современный анализ функциональных свойств белков помимо методов биохимии и молекулярной биологии требует применения клеточных технологий, особенно в аспекте разработки медицинских средств различного назначения. Кроме того, создание диагностических систем напрямую связано с пониманием процессов патогенеза. Поиск и получение углевод-связывающих белков, способных распознавать аберрантное гликозилирование опухолевых клеток, невозможно без современных знаний и навыков в областях клеточной биологии, медицинской биохимии и гликобиологии. Структурный анализ биополимеров, относящийся главным образом к биофизике, имеет важнейшее значение в рациональном дизайне рекомбинантных белков как инструмент проверки и предсказания возможных изменений их свойств. Среди используемых в Лаборатории подходов и методов можно выделить следующие:

1. Скрининговые методы для определения агглютинирующей активности и углеводной специфичности углевод-распознающих белков (РГА, ИРГА, фронтальная аффинная хроматография, лектиновые микроматрицы).

2. Хроматографические подходы для выделения и очистки углевод-распознающих белков (аффинная хроматография, ионообменная хроматография, гель-фильтрация, хроматография гидрофобных взаимодействий).

3. Рутинные методы определения полипептидного состава, аминокислотных последовательностей и олигомерных состояний углевод-распознающих белков (электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих/неденатурирующих условиях, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия).

4. Биофизические методы для количественного определения углеводной специфичности углевод-распознающих белков к углеводным лигандам (поверхностный плазмонный резонанс, атомно-силовая микроскопия одиночных молекул высокого разрешения, ИК-спектроскопия, анализ теплового сдвига комплексов «белок-лиганд»).

5. Методы определения пространственной структуры углевод-распознающих белков и их комплексов с углеводными лигандами (монокристальная рентгеновская дифракция высокого разрешения, малоугловое рентгеновское рассеяние, спектроскопия ядерного магнитного резонанса).

6. Методы для определения аберрантных паттернов гликозилирования опухолевых клеток (биоинформатический поиск гликановых сигнатур по анализу транскриптомных и гликопротеомных данных, лектиновая аффинная хроматография, ультра высокоэффективная хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией высокого разрешения, иммуноблоттинг).

7. Методы белковой инженерии (получение рекомбинантных форм углевод-распознающих белков в различных системах экспрессии, разработка библиотек мутантных углевод-распознающих белков с помощью рационального дизайна, рандомного и сайт-направленного мутагенеза).

8. Методы химической модификации углевод-распознающих белков (конъюгация с флуоресцентными носителями)

9. Методы микроскопии (световая, флуоресцентная, лазерная сканирующая и электронная микроскопия).

Многие морские организмы уже являются источником биотехнологически ценных биополимеров, в том числе белков и полисахаридов. Углевод-связывающие белки встречаются во всех организмах от вирусов, бактерий и одноклеточных до цветковых растений и высших позвоночных. Особый интерес в связи с активным развитием биомедицинских разработок представляют углевод-распознающие белки-агглютинины беспозвоночных, которые ранее относили только к лектинам, однако с прогрессом геномных исследований список групп лектин-подобных белков значительно расширился. Особенно в этом свете выделяются представители типа Mollusca, в частности двустворчатые моллюски, у которых обнаружено крайне высокое разнообразие кодирующих углевод-связывающие белки структур. Также сотрудниками лаборатории уже проведен скрининг углеводной специфичности агглютининов из представителей систематических групп Polychaeta, Sipuncula, Thecostraca, Malacostraca, Holothuroidea, Asteroidea и данный список планируется расширять.

География исследований включает главным образом морские акватории Дальнего Востока России, в частности прибрежные воды Японского моря, которые характеризуется особым биоразнообразием уникальностью некоторых обитающих здесь видов. Однако предметом исследований могут стать структурно-функциональные свойства биополимеров из любых морских организмов, включая глубоководных представителей из других регионов.

Сотрудники Лаборатории имеют доступ к оборудованию общего пользования ННЦМБ ДВО РАН, а также к площадям и приборной базе Центров коллективного пользования «Дальневосточный центр электронной микроскопии» и «Приморский океанариум», а также оборудованным лабораторным помещениям морской биологической станции «Восток».

Лаборатория создана в мае 2024 года в рамках федерального проекта «Развитие человеческого капитала в интересах регионов, отраслей и сектора исследований и разработок» национального проекта «Наука и университеты» на основании отбора заявок 2023 года по созданию молодежных лабораторий.

Проводимые сейчас исследования

Биологическое разнообразие мирового океана является источником колоссального разнообразия химических соединений, структуры которых и различные функциональные свойства сформировались за длительную эволюцию жизни в морской среде. Среди множества низкомолекулярных соединений, выделенных из морской биоты, к настоящему моменту открыты и нашли свое практическое применение в медицине, фармации и биотехнологии значительное число молекул, в том числе и такие, принципиально новая организация которых, обеспечила создание новейших средств для противоопухолевой терапии и регенеративной медицины. Отдельное место занимают высокомолекулярные соединения морских организмов, среди которых важное значение принадлежит углеводам различного строения и белкам, которые вместе обеспечивают механизмы молекулярного распознавания, участвующие в межклеточной ассоциации, сигнализации и взаимодействиях с внеклеточным матриксом и компонентами внешней среды. Механизмы молекулярного распознавания, в которых специализированные белки способны специфически связывать углеводы, гликаны и гликоконъюгаты, обеспечили развитие многоклеточности, интеграцию клеток друг с другом и сформировали основные механизмы иммунной защиты. В отсутствие иммуноглобулинов углевод-связывающие белки, названные изначально лектинами, но теперь включающие несколько независимых групп структурно неоднородных биополимеров, стали основой иммунитета многих беспозвоночных животных, а геномы отдельных систематических групп включают сотни генов, кодирующих эти белки. Поиск новых молекул из данной группы, изучение их структуры и функциональных свойств представляет большой практический интерес, поскольку с их помощью возможно создание новых средств для персонализированной медицины и ветеринарии. В частности, с помощью таких молекул возможно создание систем диагностики онкологических заболеваний, поскольку эти белки способны распознавать молекулярные паттерны аберрантного гликозилирования клеток и тканей, что позволяет идентифицировать отдельные фенотипы опухолевых клеток. Отдельным направлением работ, активно развиваемым в последнее время, стала гликобиология, комплексно изучающая биологическую роль углеводов различного строения – сильно недооцененную в прошлый период группу химических соединений. Многие углеводы, выделенные из морских организмов, уже нашли разнообразное практическое применение, а изучение структурно-функциональных механизмов взаимодействия углеводов и белков представляет как фундаментальный интерес так, и обеспечивает развитие биотехнологии и биомедицины. Основные интересы созданного научного коллектива сфокусированы прежде всего на изучении биополимеров морских организмов, биотехнологии их продуцентов и на создании решений на основе принципов молекулярной биоинженерии, которые будут способствовать развитию биомедицинских и ветеринарных технологий, технологий персонализированной медицины, которые входят в число приоритетных направлений научно-технологического развития России.

На период 2024-2026 гг. в основе деятельности лаборатории лежит выполнение проекта: «Структурно-функциональные свойства и молекулярная биоинженерия углевод-связывающих белков морских организмов для создания биомедицинских технологий». Целью проекта является получение, рациональный дизайн и выявление структурно-функциональных свойств белков морских организмов, способных распознавать специфические паттерны гликозилирования биоструктур, для создания технологий персонализированной медицины и формирования компетентностного задела в области синхротронных исследований биологически активных молекул. Основными задачами являются: поиск перспективных для биотехнологии и биомедицины природных углевод-связывающих белков и их кодирующих структур; получение рекомбинантных форм белков-кандидатов; изучение структурно-функциональных свойств природных и рекомбинантных углевод-связывающих белков; создание прототипов систем молекулярного распознавания биомедицинского назначения на основе оригинальных препаратов углевод-связывающих белков; формирование коллектива исследователей, способных сочетать разнообразные методы биоинженерии и рационального дизайна природных биополимеров, а также передовые синхротронные структурно-функциональные исследования для получения биотехнологически ценных продуктов, способствующих развитию персонализированной медицины.

Основные фундаментальные и прикладные результаты:

1. Из плазмы гемолимфы двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis выделен и идентифицирован новый углевод-связывающий белок MkC1qDC, получена его аминокислотная последовательность и описаны структурно-функциональные свойства. MkC1qDC имеет максимальный аффинитет в отношении гликанов на основе кислых производных галактозы и маннозы, локализован в гемальной системе и интерстициальном компартменте моллюска, проявляет Са²⁺-зависимую агглютинирующую активность и выраженные антибактериальные свойства. Кроме того, MkC1qDC дозозависимым образом подавляет пролиферацию клеток аденокарциномы человека HeLa, что указывает на биомедицинский потенциал белка MkC1qDC (Grinchenko A.V., Kriegsheim A. von, Shved N.A., Egorova A.E., Ilyaskina D.V., Karp T.D., Goncharov N.V., Petrova I.Y., Kumeiko V.V. // Mar. Drugs. 2021. Vol. 19. P. e668. DOI: 10.3390/md19120668, Q1).
2. Проведена спецификация гемоцитов двустворчатого моллюска M. kurilensis. В гемолимфе идентифицировано и охарактеризовано четыре типа клеток, среди которых обнаружена внутриклеточная локализация и наибольшее содержание углевод-распознающего белка-агглютинина MkC1qDC в базофильных гранулоцитах. Выявление мест синтеза данного белка, обладающего антимикробной активностью и способностью выявлять некоторые варианты аберрантного гликозилирования опухолевых клеток, представляет интерес для создания биомедицинских и ветеринарных технологий (Sokolnikova Y., Mokrina M., Magarlamov T., Grinchenko A., Kumeiko V. // Heliyon. 2023. Vol. 9. P. e15577 DOI: 10.1016/j.heliyon. 2023. e15577, Q1; Grinchenko A.V., Buriak I.A., Kumeiko V.V. // Mar. Drugs. 2023. Vol. 21. P. e570. DOI: 10.3390/md21110570, Q1).
3. С целью идентификации специфических маркеров канцерогенеза и создания экспериментальных моделей для скрининга лекарственных препаратов-кандидатов с таргетной противоопухолевой активностью получены перевиваемые клеточные культуры глиом, характеризующиеся нормальным и мутантным аллелем IDH1, кодирующим изоцитратдегидрогеназу 1. Установлено, что клетки, несущие маркерную мутацию IDH1R132H, отличаются хотя и сниженной пролиферативной активностью, но наибольшей экспрессией рецепторного белка CD44 и высокой механической жесткостью, что способствует их большей инвазивности. Для клеток с IDH1 дикого типа установлены средние (для CD44+) и низкие (для CD44-) значения жесткости, что представляет интерес для разработки новых диагностических систем (Shmelev M.E., Farniev V.M., Shved N.A., Kumeiko V.V. // Int. J. Mol. Sci. Vol. 24. P. e4056. DOI: 10.3390/ijms24044056, Q1; Penkova A.О., Kuziakova O.Y., Gulaia V.S. et al. // Front. Mol. Biosci. Vol. 10. P. e1216102. DOI: 10.3389/fmolb.2023.1216102, Q1).

Лаборатория биотехнологии и молекулярной биоинженерии ННЦМБ ДВО РАН имеет тесную связь с Лабораторией биомедицинских клеточных технологий и Центром геномной и регенеративной медицины (руководитель Кумейко Вадим Владимирович, к.б.н.) Дальневосточного федерального университета (ДВФУ, г. Владивосток, Россия). В рамках сотрудничества проводится детальное описание морфологических и цитотоксических свойств исследуемых биополимеров. В частности, ведется работа по оценке влияния получаемых белков на клетки эукариот с использованием различных клеточных линий из коллекции ДВФУ, включающей основные стандартные клеточные культуры различных эмбриональных ростков (мезенхимные, эпителиальные, нейроэпителиальные), панель культур с индуцированными драйверными мутациями, имеющими критическое значение при росте и развитии опухолей, а также уникальную коллекцию первичных клеточных культур, полученных из образцов тканей пациентов. При этом в непосредственном доступе сотрудников лаборатории находится парк уникального оборудования ДВФУ. Например, для культивирования клеток возможно использование роботизированной системы автономного культивирования клеток CompacT SelecT (TAP Biosystems) в комплектации с модулями для определения конфлюэнтности и жизнеспособности клеточных линий, а также системы непрерывного получения и анализа изображений Cell-IQ (CM Technologies), способной посредством технологии машинного распознавания образов оценивать пролиферацию и миграцию клеток. Для исследования влияния биополимеров на модельные клеточные системы возможно применение конфокальной и мультифотонной лазерной микроскопия с помощью системы глубокого оптического имиджинга биоматериалов FluoView FV1200MPE (Olympus), которая оснащена инкубатором для проведения длительных прижизненных исследований и минимизирует фототоксическое воздействие на исследуемые клетки благодаря высокочувствительным детекторам и использованию фемтосекундного инфракрасного лазера, а также способна проводить флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence), которая позволяет в реальном времени прижизненно получать высококонтрастные изображения структур вблизи мембраны клетки в области, непосредственно прилегающей к стеклу, где происходит полное внутреннее отражение. Для изучения наномеханических, реологических и морфологических свойств наноразмерных систем, а также силы взаимодействия “белок-клеточная поверхность”, возможно использование атомно-силовой микроскопии с помощью прибора Bioscope Resolve (Bruker), созданного на базе инвертированного флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio Observer A1 и дополненного микрофлюидной системой FluidFM. Оценка аффинитета и констант взаимодействия “белок-лиганд“ возможно как атомно-силовой микроскопией, так и поверхностным плазмонным резонансом с помощью системы системы Biacore X100 (General Electric).

Сотрудничество с Лабораторией цифровых управляемых лекарств и тераностики ФИЦ "Красноярский научный центр СО РАН" (руководитель Кичкайло Анна Сергеевна, д.б.н.) позволит перенять компетенции и адаптировать опыт в разработке диагностических и терапевтических систем на основе направленной селекции ДНК аптамеров к биологическим мишеням, которые являются биомаркерами опухолевых клеток глиобластомы, рака легкого и молочной железы, в приложении к диагностическому потенциалу углевод-связывающих белков. Экспертиза членов Лаборатории цифровых управляемых лекарств и тераностики в исследовании структуры нуклеиновых кислот и их комплексов с другими биополимерами методом малоуглового рассеяния (SAXS) будет активно применяться в структурном анализе углевод-связывающих белков, а их компетенции в молекулярном моделировании и молекулярном докинге помогут в рациональном дизайне исследуемых углевод-связывающих белков.

Информацию подготовил с.н.с. Гринченко А.В.